FARKLI KARBON KAYNAĞI VE BESİYERİ PH DEĞERİNİN PİCHİA PASTORİS MAYASININ REKOMBİNANT PROTEİN ÜRETİMİNE OLAN ETKİSİNİN İNCELENMESİ

Abstract

Meyveler hoşa giden tat, aroma ve renklerinden dolayı özelliği tarafından rağbet ekonomik görünen değeri yüksek ürünlerdir. Ancak meyvelerin hasadının ardından solunumunun devam etmesi ve ortaya çıkan biyokimyasal değişimlerin bozulması ve parçalanma sürecinin hızlandırılması dolayısıyla hızlı bir şekilde katma değerli ürünlerin uygulanması gerekmektedir. Bu en başında da meyve suyu ve konsantresinin üretimi yapılmaktadır. Meyve suyu üretimi presleme aşamasında meyve suyu randımanı boyutu için ve berrak meyve suyu üretimi amacıyla çeşitli hücreli parçalayıcı enzimler kullanılmaktadır. Parçalanmış duvar kağıdı parçalayan enzimlere parçaları olan proteinlerden birisi de ekspanzin proteinidir. Ekspanzin proteini bitkilerde bulunan bir proteindir. Ekspanzin proteini bitkileri ekstradan az miktarda kaybederek klasik olarak elde edilirken maliyet artışına ve zaman kaybına neden olmaktadır. Ekspanzin proteinin modern biyoteknolojik dayanıklılığı için domates ( Solanum lycopersicum ) LeExp1 genini içeren Pichia pastoris konakçı hücresi çalışma kapsamı içinde kullanılmıştır. Bu olabilir P. pastoris metilotropik mayasının optimum fermentasyon koşullarının belirlenmesinin devamı. Bu amaçlanan, karbon kaynağı metanole ikamesi olarak gliserol, sorbitol ve mannitol besiyeri pH değeri olarak da 4.0-5.0-6.0-7.0 ve tüm deneme desenleri için fermentör sıcaklığı 30 ºC olacak şekilde 16 adet deneme deseni belirlendi. Sonuçlar karbon kaynağının metanol ve besiyeri pH 6.0 olduğu fermentasyon koşulları ile karşılaştırılmıştır. Araştırma kapsamında rekombinant mayaların biyokütle miktarı, fermentasyon ortamındaki toplam protein miktarı, RNA transkripsiyonu ve Western Blot analizleri gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonucunda pH değeri 7.0 ve karbon kaynağının metanol ile birlikte sorbitol veya gliserol fabrikası çalışır durumda P. pastoris'in biyokütle kapasitesi 21,3 ve 34,7 mg/mL ve fermantasyon ortamındaki toplam protein kapasitesi ise 30,35 ve 30,00 mg/mL'dir. olarak ölçülmüştür. Yapılan RNA Transkripsiyon analizi ile agaroz jel üzerinde LeExp1 geninin varlığı inkübasyonun tüm aşamalarında (24-48-72-96.sa.) gözlenmiştir. RNA Transripsiyon analizi ile LeExp1 geninin başarılı bir şekilde konakçı organizma olan P. pastoris'e aktarıldığı ve transkribe edildiği doğrulanmıştır. P. pastoris'in salgıladığı proteinler SDS Sayfa analizi ile jel üzerinde parçalanmış ve 30 kDa boyutunda ekspanzin proteinin varlığı tespit edilmiştir. SDS Sayfası jeli Western Blot analizi ile PVDF membrana blotlanarak ekspanzin proteininin varlığı spesifik antikor ile tespit edilmiştir.