ŞANLIURFA BÖLGESİNDEKİ EVCİL KANATLILARDAN Mycoplasma gallisepticum İZOLASYONU ve MOLEKÜLER KARAKTERiZASYONU

Abstract

Bu çalışma, Şanlıurfa bölgesindeki evcil kanatlılarda yaygın olarak görülen kronik solunum yolu hastalığı (Chronic Respiratory Disease) (CRD)’nın etkeni olan Mycoplasma gallisepticum (M. gallisepticum) (MG)’un yerel suşlarını izole etmek, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile etkeni moleküler olarak doğrulamak, izole edilen suşların amplifiye edilen mgc2 gen bölgelerine, sekanslama ve Restriction fragment length polymorphism (RFLP) ile filogenetik analiz yapmak, referans M. gallisepticum S6 suşu ve M. gallisepticum 6/85 aşı suşu ile, izole edilen saha suşları arasında protein profillerini karşılaştırmak ve hastalıkta oluşan antikorları saptamak amacı ile Western blot (WB) analizlerinin yapılması amacıyla yürütüldü. Çalışmada hayvan materyali olarak 120 evcil kanatlıya ait trakeal svab ve doku örnekleri etken izolasyonu için kullanıldı. İzolasyon çalışması sonucunda, 3 tanesi tavuklara, 4 tanesi ise hindilere ait olan toplam 120 örneğin 7’sinden (%5.8) M. gallisepticum izole edildi. PCR analizi sonucunda, 120 örneğin 65 (%54.2)’i M. gallisepticum yönünden pozitif bulundu. 62 tavuğun 30 (%48.3) ‘unda ve 58 hindinin 35 (%60.3)’inde türe özgü DNA tespit edildi. Çalışmada kullanılan 84 trakeal svab örneklerinin 42 (%50)’sinde ve 36 doku homojenatı örneklerinin 23 (%63.9)’ünde türe özgü DNA tespit edildi. Mgc2F ve mgc2R hedef gen bölgelerinin 750-800 bp’de amplifiye edilen PCR ürünlerinin sekanslama sonucunda baz aralıkları (bp) MG4 714 bp, MG79 782 bp, MG9 721 bp, MG68 716 bp, MG95 716 bp, MG120 712 bp, MG66 782 bp, M. gallisepticum 6/85, 718 bp ve M. gallisepticum S6, 787 bp’de elde edildi ve kesim bölgeleri sekans baz aralıkları ile analiz edildi. Elde edilen PCR ürünlerinin AluI, HaeII, HinfI Restriksiyon enzimleri (RE) ile kesimleri sonucu 2 farklı PCR-RFLP tipi elde edildi. MG4, MG9, xi MG68, MG95, MG120 izolatlarının çoğu aynı PCR-RFLP profili gösterirken, MG66 ve MG79 izolatları ise farklı profil gösterdi. Çalışmada değerlendirilen M. gallisepticum 6/85 aşı suşu ise MG4, MG9, MG68, MG95, MG120 saha izolatlarına yüksek oranda benzer RFLP profilleri gösterdi. M. gallisepticum S6 suşu ise yüksek oranda farklı kesim profili şekillendirdi. İzolatların Mgc2 gen bölgesinin filogenetik analizi sonucu; birbirine yüksek oranda benzer 5 saha izolatı birinci grup (Grup 1: MG4, MG9, MG68, MG95, MG120), 2 saha izolatı ise benzer ikinci grup (Grup 2: MG66, MG79) şeklinde oluşturuldu. Grup 1 ve Grup 2’ de yer alan saha izolatları, Güney Afrika ve Brezilya’da ki izolatlara %96-99, Hindistan, Amerika ve Avustralya ’da ki izolatlarla ise %96-100 arasında benzerlik gösterdi. Ayrıca Grup 1 ve Grup 2’de yer alan izolatlar, sırasıyla 6/85 aşı suşuna %99.5 ve %97.3 oranında, TS-11 aşı suşuna %89-90 ve %100, M. gallisepticum S6 suşuna ise %96-96.5 ve %97.2 oranında benzerlik gösterdi. Sadece M. gallisepticum 6/85 ve Grup 1’de yer alan saha izolatlarının mgc2 genine ait nükleotit baz dizisinde 63 nükleotidin delesyona uğradığı tespit edildi. Sodyum Dodesil Sülfat– Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) analizi sonucu Grup 1 ve Grup 2’de yer alan saha izolatlarının hepsinde belirgin olan 120, 100, 70, 64, 67, 56, 53, 45, 43, 26 kDa ağırlığında protein bantları gözlemlendi. MG68 ve MG95 ile Grup 2’de yer alan izolatlar, diğerlerinden farklı olarak 28 kDa’da bant oluşturdu. Grup 2’deki izolatlar da ayrıca 15 kDa ağırlığında bant oluşturdu. M. gallisepticum 6/85 aşı suşu ve standart M. gallisepticum S6 suşu’nda belirtilen tüm protein bantları şekillendi. M. gallisepticum türüne özgü proteinlere karşı oluşan antikorların WB analizi Grup 1 ve Grup 2’de yer alan saha izolatların hepsinde p200, p120, p100, p98, p67, p64, p40, p35, p26’ya karşı antikor şekillendi. Grup 1’de yer alan izolatlar da ayrıca p56 ya karşı antikor oluşturdu. WB analizi için poliklonal serum kullanılması ile, bazı M. gallisepticum izolatları arasında antijenik olarak farklılaşma gözlenebilse de, WB analizinde monoklonal antikorların kullanılmasının, antijenite ve immünojenisite açısından daha spesifik ayrım sağlayabileceği tahmin edilmiştir. Sonuç olarak bu çalışma ile, Şanlıurfa bölgesinde CRD yönünden şüpheli semptom gösteren evcil kanatlılardan patojenik M. gallisepticum etkeninin mevcudiyeti, ve infeksiyonun kanatlı türlerindeki yaygınlığı hakkında ön bilgiler edinildi, hastalık için epidemiyolojik açıdan bir farkındalık oluşturuldu. Kullanılan moleküler yöntemlerin epidemiyolojik yönden saha ve aşı suşlarını ayırt etmede kullanılabileceği, xii ayrıca bu yöntemlerle izolatlar arasında var olan farklılıkların saptanılabileceği gözlemlendi. Mevcut verilere dayalı olarak saha suşlarının daha fazla tanınması ve tanımlanması için farklı M. gallisepticum genleri üzerinde daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Ayrıca bölgede bulunan sonuçların, M. gallisepticum infeksiyonu teşhis olasılığını artıracağı, yani aşı suşuna bağlı nihai hastalığı netleştirmede, aşılanmış sürüleri doğal olarak infekte olmuş sürülerden ayırt etmede ve mikoplazma infeksiyonlarının izlenmesi yönünde etkili olacağı düşülmektedir.