Oryctolagus cuniculus kimozin geninin Pichia pastoris'te ekspresyonunun optimizasyonu / Optimization of Oryctolagus cuniculus chymosin gene expression in Pichia pastoris

Abstract

Rekombinant kimozin üretiminde inek, kuzu, bufalo, keçi, domuz, deve gibi birçok hayvandan klonlanan kimozin genleri kullanılsa da tavşan kimozin geninin rekombinant olarak üretilmesini konu alan bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada öncelikle tavşan kimozininin peynir yapımına uygunluğunun belirlenmesi amacı ile tavşan renneti, ticari buzağı ve deve kimozinleri kullanılarak beyaz peynir üretimi yapılmış ve 60 gün depolanmıştır. Yapılan çalışmalarda tavşan renneti ile üretilen peynirlerin buzağı kimozini ile üretilen peynirlerden duyusal ve proteolitik açıdan üstünlük, deve kimozini ile üretilen peynirler ile de benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Bu ön çalışmalar doğrultusunda rekombinant tavşan kimozini üretimi için tavşanda bulunan kimozin gen diziliminin pre, pro ve aktif bölgeleri biyoinformatik analizler ile belirlenmiş, belirlenen pro-kimozin enzimi kodon optimizasyonu yapıldıktan sonra pPIC9K vektörüne klonlanmıştır. Tavşan kimozin genini içeren pPIC9K vektörü, Pichia pastoris GS115 suşuna elektroporasyon yöntemi ile aktarılmıştır. Antibiyotik (0.25, 0.50, 1.0, 2.0, 4.0 mg/mL genetisin) içeren YPD agarda kademeli olarak geliştirilmiş tek kolonilerden antibiyotiğe en dirençli olan (4.0 mg/mL genetisin içeren besi ortamında gelişebilen) koloniler seçilerek farklı sıcaklıklar (20, 25, 30 ºC) altında AOX1 promotörü kontrolünde 96 saat boyunca ekstraselülar protein üretimi yapılmıştır. Belirlenen optimum fermentasyon sıcaklığında farklı pH (3.0, 4.0, 5.0, 6.0) değerlerine sahip BMM besiyerlerinde ekspresyon tekrarlanarak optimum besiyeri pH'ı belirlenmiştir. Maksimum protein verimi 30ºC'de ve pH'ı 6.0 olan besiyeri kullanılarak yapılan ekspresyon sonucu elde edilmiştir. SDS-PAGE analizi sonucunda kimozin (40 kDa) ve glikolize kimozine (45 kDa) ait bantlar elde edilmiştir. Aktif kimozinin 40 ºC ve 75 mM CaCl2 konsantrasyonunda %100 aktivite gösterdiği ve pH 3.0- 6.0 arasındaki değerlerde stabilitesini koruduğu gözlemlenmiştir. Ayrıca rekombinant tavşan kimozininin eşek, inek, keçi, koyun, deve sütleri üzerlerindeki aktiviteleri sırası ile 40, 10, 5.7, 3.07, 2.66 IMCU/mL olarak belirlenmiştir. Rekombinant tavşan kimozininin kazein üzerindeki proteolitik özellikleri incelendiğinde ise α-kazeini parçalamadığı, β-kazeini az miktarda κ-kazeini ise tamamen parçaladığı gözlemlenmiştir. Sonuç olarak rekombinant kimozinin diğer hayvansal kimozinlere iyi bir alternatif pıhtılaştırıcı ajan olabileceği ve peynir endüstrisinde kullanılabileceği ortaya konmuştur.