Brucella melitensis Rev1 yüzey membran proteinin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve diagnostik etkinliğinin tespit edilmesi / Brucella melitensis Rev1 surface membrane protein's cloning, expression, purification and determine of diagnostics to the effectiveness

Abstract

Brusella, aerobik, spor oluşturmayan, hareketsiz, gram negatif bir kokobasil olup, insanlarda kronik enfeksiyona neden olan, NIH/CDC'ye göre B kategorisinde bir bioterör ajanıdır. Bruselloz, hayvanlardan ya da bunların ürünlerinden insanlara bulaşan zoonotik bir hastalıktır. Türkiye'de dahil olmak üzere birçok gelişmekte olan ülkede; hem halk sağlığı hem de ekonomik önemi olan bir zoonozdur. Erken teşhis ve enfekte hayvanların ayrımı, hastalığı kontrol etmek için önemlidir. Brusella için serodiagnostik testler, hücrenin lipopolisakkarid (LPS) bileşenine karşı geliştirilmiş antikorların saptanması temeline dayanır. Ancak, diğer gram negatif bakterilerle çapraz reaksiyon nedeniyle yanlış pozitif sonuç vermesi bu yöntemin yararını sınırlamaktadır. Bu çalışmada, LPS `ye alternatif olarak Brucella melitensis Rev1'e ait antijenik dış membran proteini (omp28 precursor) klonlandıktan sonra üretilip saflaştırıldı. Rekombinant proteinin tespitini ve saflaştırılmasını kolaylaştırmak için N-terminal kısmına His-sumo tag eklenmiştir. B. melitensis Rev1 omp28 precursor geninin, ORF gen bölgesi PCR ile çoğaltılıp, direkt olarak pETSUMO vektörüne klonlandı. Klonlanan plazmitinin bütünlüğü PCR ve sekans analizi kullanılarak doğrulandı. Recombinant vektör E. coli One Shot® Mach1? hücrelerinde çoğaltıldıktan sonra, E. coli BL21(D3) hücrelerine transfer edilip, protein ekspresyonu IPTG ile indüklendi. Eksprese edilen rekombinant protein Ni-agaroz kromatografisi ile saflaştırıldı ve anti-His antikoru kullanılarak yapılan westernblot ve dot blotla doğrulandı. Saflaştırılmış omp28 precursor proteinin brusella teşhisindeki etkinliği, Şanlıurfa'da çeşitli hastanelerden toplanan serumlarla indirect enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) yapılarak çalışıldı. Pozitif ve negatif olduğu bilinen serum örnekleri kullanıldığında omp28 precursor proteinin brusella enfekte insan serumlarında immünreaktif olduğu tespit edildi. Altmış insan serumu; omp28 precursor antijen tabanlı ELISA testi ile tarandı ve sonuçlar Rose Bengal Plate aglütinasyon testi (RBPT) ile karşılaştırıldı. Rekombinant omp28 precursor temelli ELISA testinin; sensivitesi % 87,8 spesifitesi % 96,2 pozitif prediktif değer % 96,6 negatif prediktif değer % 78,7 ve test geçerliliği % 91,6 olarak tespit edildi. Rekombinant B. melitensis Rev1 omp28 precursor proteinin insan bruselloz tanısı için bir protein antijeni olarak kullanılabileceği sonucuna varıldı. ANAHTAR KELİMELER: Brucella melitensis Rev1, Omp28 precursor, Rekombinant DNA, Klonlama, Protein ekspresyonu, Protein Saflaştırma, ELISA