Oryctolagus cuniculus (tavşan) genomundan kimozin geninin izolasyonu ve karakterizasyonu / Isolation and characterisation of Oryctolagus cuniculus (rabbit) chymosin

Abstract

Hayvansal kaynakların sınırlı olması, yüksek maliyet ve artan maya ihtiyacının karşılanamaması gibi sorunlardan dolayı mikrobiyal kimozin üretim çalışmaları yapılmıştır. Buzağı genomundan izole edilen kimozin gen dizilim bilgisi rekombinant kimozin üretimi amacıyla kullanılmıştır. Buzağı kimozin geni uygun şekilde inşa edilen vektörlere yerleştirilerek E. coli bakterilerine aktarılmış ve fermentasyon ortamında transforme bakterilerin istenilen rekombinant kimozin üretimleri teşvik edilmiştir. Rekombinant buzağı kimozininde elde edilen başarı farklı memeli türlerinden izole edilecek olan kimozin genlerinin bu amaçla kullanılabileceğine işaret etmiştir. Bunun üzerine domuz, buffalo, kuzu, keçi ve son olarak deve, gibi memelilerin kimozin genleri üzerine araştırmalar yapılmış, bu genlerin karakterizasyonu yapılmış, gen dizilimleri belirlenmiş ve endüstriyel peynir üretiminde kullanılmak üzere rekombinant olarak üretimleri sağlanmıştır. Son otuz yıldan günümüze kadar birçok rekombinant kimozin kaynağı geliştirilmiştir. Farklı kimozin kaynakları için araştırmalar hala devam etmektedir. Tavşan midesinden (abomasum) izole edilen rennetin peynir yapımı için önemli bir kaynak olduğu belirtilmekte ve peynir üretiminde kullanılabilme potansiyeline sahip olduğu öngörülmektedir. Ancak tavşanın kimozin geninin karakterizasyonuna ve gen diziliminin belirlenmesine yönelik yapılan çalışmalar sınırlıdır.Bu çalışmada Oryctolagus cuniculus (tavşan) genomundan kimozin geninin izole edilip karakterizasyonun yapılması için tavşan dokusundan DNA izolasyonu yapılmıştır. İzole edilen tavşan DNA'sından PZR analizleri ile kimozin geni izole edilmiştir. Biyoinformatik analizler ile tavşan genomu üzerinde kimozin lokusunun 13. Kromozom üzerinde 53.709.000-53.717.500 bazları arasında olduğu tespit edilmiş ve ekzon- intron bölgeleri belirlenmiştir.Filogonetik analizlerle tavşan kimozin geninin diğer memeli türleri ile olan evrimsel akrabalığı incelenmiş ve tavşan kimozinin diğer memelilere ait kimozin genlerinden farklı bir grubta olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte kimozin genlerinin korunmuş olan motifleri incelenmiştir. Bu incelemeler sonucunda kimozin geninde aktif bölgelerin çalışılan tüm memeli türlerinde korunduğu tespit edilmiştir. Protein modelleri incellendiğinde korunan aktif bölgelerin diğer türlerde aynı yapıları oluşturduğu ve akitf bölgelerin konumunun aynı olduğu gözlenmiştir. The investigation on microbial chymosin production was carried out because of limited availability of animal resources. The sequence of cattle chymosin gene was used for the recombinant chymosin enzyme production. The recombinant chymosin enzyme production was induced in E. coli by using a suitably constructed vector carrying corresponding transgene sequence. The success obtained for recombinant Bos taurus chymosin enzyme paved the way for the investigation of novel chymosin sources. For this purpose pig, buffalo, lamb, goat, and camel, was used as gene source and the genes obtained from these organisms were characterized and sequenced. In the last decades several chymosin sources were studied and investigated for their possible use in food industry and newstudies in this area is also currently being continued. The rennet obtained from rabbit stomach was also used for milk clotting. But the study of gene sequence and characterisation of Oryctolagus cuniculus(rabbit) chymosin gene is limited in the literature. In this study firstly DNA was extracted from tissue of rabbit because of isolation of chymosin gene from rabbit by PCR. Rabbit chymosin gene locus was determined on 13th chromosome and between 53.709.000-53.717.500 bases and exon-intron sites were determined by bioinformatic analyses. MUSCLE and Clustal W was used to determinethechymosin gene sequence of rabbit and the other cyhmosin gene sequence of mammalian species. The evolutionary relationship of chymosin gene of rabbit was examined by the phylogenetic analyses and the result of these analyses show that the rabbit chymosin gene was determined as different in group and so might have more characteristic properties different than chymosin genes of other mammalian species.