İnsan serumunda paraoksonaz enziminin saflaştırılması ve aktivitesinin araştırılması / Purification of human serum paraoxonase enzyme and investigation of activity

Abstract

Paraoksonaz enzimi ilk olarak organofosfor zehirlenmesine karşı koruyucu bir bariyer olarak tanımlanmıştır. Bu enzim hakkında son yıllarda oldukça fazla sayıda araştırma yapılmış olup, sahip olduğu fonksiyonlar ve hastalıklardaki rolü hakkında büyük ilerleme kaydedilmiştir. Paraoksonaz 1 (PON1) enzimi, esteraz ve laktonaz aktivitesi gösteren yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) ilişkili bir enzimdir. Oksidatif strese karşı önemli bir antioksidan olarak görev yapan bu enzim, kanser ve kardiyovasküler hastalıklar başta olmak üzere birçok hastalığın patogeneziyle ilişkilendirilmektedir. Paraoksanaz enziminin hastalık patogenezindeki fonksiyonlarını inceleyebilmek için saflaştırılması gerekmektedir. Bu çalışmada insan serum paraoksanaz-1 enzimi; amonyum sülfat çöktürmesi, jel filtrasyon kromatografisi, iyon değişim kromatografisi ve non-spesifik afinite kromatografisi yöntemleriyle saflaştırıldı. Çalışma sonucunda paraoksanaz enzimi; amonyum sülfat çöktürmesi, sephadex G-200 jel filtrasyon kromatografisi, DEAE-Sephadex A 50 anyon degisim kromatografisi ve afinite kromatografisi teknikleri ile %25 verimle 206 kat saflastırıldı. Ayrıca spesifik aktivitesi 347,5 U/mg protein olarak tespit edildi. Saflaştırılan enzimin saflığı; SDS poliakrilamid jel elektroforezi uygulanarak yaklaşık 43 kDa molekül ağırlığına sahip tek bant elde edilmesi ile tespit edildi. Anahtar Kelimeler: İnsan serum PON1, Saflaştırma Paraoxonase enzyme has initially been identified as a protective barrier against organophosphorus poisoning. In the recent years, a wide range of investigations were conducted on this enzyme and the knowledge about its functions and the etiopathogenetic role in some diseases has been clarified in depth. PON1 is a high density lipoprotein-associated enzyme that have esterase and lactonase activities. PON, as an important anti-oxidant enzyme against oxidative stress, has been implicated in the pathogenesis of a number of disorders including cancer, cardiovascular and several other diseases. Paraoxonase enzyme purification is required for function in the pathogenesis of the disease. For this purpose, our study; Paraoxanase purification was performed by ammonium sulphate precipitation, gel filtration chromatography, ion-exchange chromatography and non-spesific affinity chromatography. In conclusion; Paraoxanase enzyme was purified 206 fold with a yield of 25 % using ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sephadex anion exchange and Sephadex G-200 gel filtration chromatographies. Furthermore, human serum paraoxonase had a specific activity of 347,5 units per milligram protein found to be. The purity of purified human serum paraoxonase enzyme was checked, by yielded a single band of 43kDa on SDS-PAGE. Keywords: Human serum PON1, Purification