Pichia pastoris mayalarından rekombinant ekspanzin üretiminin optimizasyonu / Optimization of recombinant expansin production from Pichia pastoris yeast

Abstract

Bu çalışmada Solanum lycopersicum (domates) bitkisinden ekspanzin üretiminden sorumlu gen bölgesi (LeExp1) izole edilerek metilotropik bir maya olan Pichia pastoris mayalarında rekombinant olarak ekspanzin proteinlerinin üretilmesi sağlanmıştır. LeExp1 gen dizilimi sırasıyla alfa mating faktör (AMF) ve Pichia pastoris asit fosfataz (PHO1) sekresyon sinyal sekanslarına sahip pPIC9K ve pHIL-S1 vektörlerine uygun enzimler vasıtasıyla aktarılmıştır. Hedef gen ile klonlanmış vektörler ısı şoku yolu ile E. coli JM109 hücelerine transforme edilmiş ve burada çoğaltılmıştır. Klonlanan vektörler elektroporasyon vasıtasıyla Pichia pastoris GS115 ve SMD1168 suşlarına transfer edilmiştir. PZR yöntemiyle transfer işlemi doğrulanmıştır ve elde edilen dört adet transgenik suştan ekstraselülar rekombinant protein üretimi AOX1 promotörü kontrolünde, pH 6.0'da, 200 rpm'de, 30°C'de 96 saat boyunca gerçekleştirilmiştir. Eksprese edilen toplam protein miktarı Bradford assay analizleri ile hesaplanmış ve elde edilen proteinler SDS-PAGE yöntemi ile poliakrilamid jel üzerinde görüntülenmiştir. Western-Blot yöntemi ile poliklonal ekspanzin antibadileri kullanılarak ekspanzin proteinleri tanımlanmıştır. Elde edilen ekspanzin proteinlerinin meyve suyu endüstrisinde kullanılan selülozik enzimlere olan sinerjistik etkileri araştırılmıştır. Çalışma sonunda pPIC9K vektörünü taşıyan, proteaz enzimleri inhibe edilmiş SMD1168 transgenik suşundan 283 mg/L düzeyinde, GS115 suşuna göre yaklaşık olarak 1.4 kat daha fazla rekombinant ekspanzin proteini elde edilmiştir.