Pamukta yüksek sıcaklık stresi ile ilişkili genlerin farklılık gösterim yöntemiyle belirlenmesi / Determination of heat stress related genes in cotton by differential displal technique

Abstract

Bitkilerin abiyotik strese karşı gösterdikleri tepkinin genetik, fizyolojik ve biyokimyasal mekanizmalarını giderek daha iyi anlamamız, abiyotik stres koşullarına daha iyi uyum sağlayacak bitkiler geliştirmemizi kolaylaştıracaktır. Pamuğun sıcaklık stresine karşı moleküler düzeydeki tepkisiyle ilişkili sınırlı bilgi nedeni ile bu çalışmada, orta ve yüksek sıcaklık stresi koşullarında pamukta sıcaklıkla ilişkili bir kısım genleri tespit etmek ve anlatım düzeyleri hakkında fikir sahibi olmak amaçlanmıştır. Bugüne kadar stresle ilişkili olduğu tespit edilen genlerin çoğu, moleküler genetikte model bitki olarak kullanılan Arabidopsis thaliana'da bulunmuştur. Fakat önemli bir tarım bitkisi olan pamuğun, sıcaklık stresi koşullarında moleküler düzeyde gen anlatımının nasıl düzenlendiği hakkında yetersiz bilgi bulunmaktadır. Bu çalışma, sıcaklık stresi koşullarında pamukta (Gossypium hirsutum L.) farklı anlatım yapan bir kısım genlerin belirlenmesi ve belirlenen genlerin sıcaklık stresi koşullarında anlatımlarının kısmen anlaşılması amacıyla yürütülmüştür. Bu amaç doğrultusunda pamuklar iklim kontrollü bitki yetiştirme dolabında ortalama 28 °C sıcaklık ve 14 saat aydınlık, 10 saat karanlık döngüde yetiştirilmiştir. 77 günlük pamuklara 38 °C ve 45 °C sıcaklık stresi uygulanmış ve farklılık gösterim tekniği kullanarak stres uygulanan bitkiler, kontrol bitkileri ile mRNA transkripsiyonu düzeyinde karşılaştırılmıştır. Farklılık gösterim tekniği aracılığıyla, sıcaklık stresi koşullarında anlatımları değiştiği belirlenen cDNA'lar izole edilmiş ve klonlanmıştır. Klonlanan cDNA'ların 13 tanesi doğrudan veya dolaylı olarak 14 gen ile homoloji oluşturmuş, 8 tanesi ise bilinen herhangi bir gen ile önemli benzerlik göstermemiştir. Bu bulgular ışığında, pamuktan izole edilen ve gen homolojisi göstermeyen 8 cDNA'nın yeni gen adayları oldukları söylenebilir. Sıcaklık stresi koşullarında izole edilen ve gen homolojisi gösteren 13 cDNA'dan 9 tanesinin anlatımı artmış, 1 tanesi azalmış, 1 tanesi baskılanmış, 2 tanesi ise 38 °C'de artarken, 45 °C'de baskılanmıştır. Yeni gen adayı olan 8 cDNA'nın 7 tanesinin transkripsiyonu, sıcaklık stresi ile şu şekilde değişmiştir; 4 tanesi artmış, 2 tanesi azalmış, 1 tanesi ise 38 °C'de artarken, 45 °C'de baskılanmıştır. 8 yeni gen adayı içerisinde yer alan 1 cDNA'nın, iki izoformu (HSGh 29 ve HSGh32) izole edilmiştir. İzoformlardan HSGh29'un anlatımı sıcaklık stresi ile azalırken, HSGh32'nin ise 38 °C'de artmış, 45 °C'de azalmıştır.